通过放射自显影的方法确定。在复制开始时将E.coli放在含低放射强度³H-脱氧胸苷的培养基中生长，数分钟后，移置含高放射性强度³H-脱氧胸苷的培养基中生长；经过一段时间后，进行放射自显影，在图像上可以看到，复制起始区的放射性标记密度低，感光还原的银颗粒密度低；继续的合成区放射性标记密度高，银颗粒密度高。若中间密度低，两端密度高，则DNA的复制为双向；如果起始部位既有高密度也有低密度，就表明DNA的复制为定点单向。研究证明多数细胞的DNA的复制为定点双向。但也有一些例外，如噬菌体P₂、质体和真核细胞的线粒体等DNA为单向复制。

用带标记的脱氧三磷酸核苷酸作为合成DNA的原料，经过一段时间后，加入碱溶液使合成停止，检查发现标记出现在小片段DNA上，追踪标记发现带标记的DNA分子质量相同而且在细胞DNA中占较多的比例。

RNA聚合酶能以DNA为模板起始合成一条新的RNA链，DNA聚合酶能够从一个RNA引物延伸DNA。在不连续DNA链的合成过程中，在复制叉解旋前进的同时，首先由引发酶(一种特殊类型的RNA聚合酶)合成RNA引物，这些引物参与了不连续合成的DNA新生片段合成的起始。

拓扑异构酶是能引起DNA拓扑异构反应的酶，它广泛存在于各种生物中，可分为两类：拓扑异构酶Ⅰ(Top Ⅰ)和拓扑异构酶Ⅱ(Top Ⅱ)。两种酶都有切断DNA分子中的磷酸二酯键，并随即又连接起来的功能，Top Ⅰ能使DNA的一条链发生断裂和再连接；Top Ⅱ能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接。
   拓扑异构酶参与DNA的复制过程，参与方式如下：
   (1)帮助复制叉上的DNA进行解旋：引入负超螺旋，消除复制叉前进时引起的扭曲张力，从而促进双链解开；
   (2)在复制叉的前面去除正超螺旋。

DNA旋转酶是一种类型Ⅱ的拓扑异构酶，能够在DNA双链中引入负的超螺旋，以消除复制叉前进时(解旋酶催化结果)引起的扭曲张力，从而促进双链解开。

DNA连接酶催化DNA双螺旋内相邻的5'磷酸基和3'羟基之间形成磷酸二酯键。换句话说，DNA连接酶能够封闭缺口。
   DNA连接酶在DNA的复制中起着不可缺少的作用，它能将后随链的片段共价结合起来。这一催化反应是发生在RNA引物被切除，空缺由DNA聚合酶Ⅰ(由冈崎片段的3'—OH引发，在这里，DNA聚合酶Ⅰ催化一种缺口平移反应)催化填补之后。
   E.coli DNA连接酶需要NAD⁺作为辅酶或提供能量，动物细胞和噬菌体DNA连接酶需要ATP作为能量来源。

DNA的复制过程比较复杂，是在多种酶和多种蛋白因子参与下共同完成的。为了清楚起见，分以下三步叙述。
   (1)复制的起始。原核生物DNA复制，开始于DNA分子特定部位，这个部位叫复制原点，或叫复制起始点，常用oriC表示。原生物只有1个起始点，真核生物有多个起始点。原核生物的复制起点具有富含AT序列，是引发复制的酶及蛋白因子结合部位，如DNA解螺旋酶、DNA旋转酶、引发体、DNA聚合酶等聚集此处组成了一个复制体。在DNA复制起始点，由DNA解螺旋酶和DNA旋转酶解开DNA双链，双链解开后单链结合蛋白(SSB)即与DNA单链结合，以防再形成双链。DNA双链解开后，由引发体中的引物合成酶以DNA为模板合成RNA引物，引物长度为几个至10个碱基，在引物的5'端含有3个磷酸残基，3'端为游离的羟基。在前导链上只需合成1个引物，在后随链上需进行多次引发，合成多个引物。
   (2)DNA链的延伸。在RNA引物合成之后，在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，按照碱基互补配对原则，以4种dNTP为底物，在引物3'端逐个加入核苷酸，DNA子链延5'→3'方向。前导链的合成是连续的，后随链合成是不连续的，由许多个冈崎片段组成，因此整个DNA分子合成是半不连续的。
   (3)复制的终止。在环状DNA分子中，单向复制的终点就是复制原点，双向复制有的有固定终点，有的没有，没有固定终点的合成，终止在两个复制叉相遇点。
   DNA链延长结束后，在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，切除引物RNA，并以碱基互补配对方式合成一段DNA填补空缺，然后由DNA连接酶连接相邻的两个DNA片段，形成新一代子链DNA。

DNA聚合酶Ⅲ、解旋酶(包括DNA解螺旋酶和DNA旋转酶)、引发酶和SSB(单链结合蛋白)。

Watson和Crick当时提出DNA双螺旋结构模型时就曾经指出，如果他们的双螺旋结构模型是正确的话，那么DNA的复制(即生物合成)应该是半保留的。由于构成DNA双螺旋结构的两条多核苷酸链按照碱基互补配对原则(即A与T，G与C互补配对)，反向平行的结合在一起，当DNA进行复制时，两条母链彼此分开，每一条链可以按照碱基互补配对的原则决定与它互补的新链的碱基顺序。于是，按照互补原则合成的子代DNA双螺旋分子，一条来自亲代，另一条链是以亲链为模板合成的。所以，DNA的复制是半保留的。

E.coli oriC位点上有规律的结构可被DnaA四聚体蛋白结合而使双链打开，DnaB、DnaC蛋白的进一步结合使双链更为展开，DnaB蛋白就是解螺旋酶。在此基础上，引物酶及其辅助蛋白结合在开链DNA上，形成引发体。

在体内，DNA两条链都能作为模板，同时合成出两条新的互补链。复制时，DNA双链解旋形成的两条单链走向相反，一条模板链为3'→5,走向，另一条链为5'→3'，复制又只能按5'→3'一个方向进行，于是，以前者为模板，DNA能以5'→3'方向连续合成，称为前导链，另一条链只能待双链解开至相当长度才开始生成引物并延长复制，这就是滞后链，即DNA复制是半不连续的。

(1)DNA pol Ⅰ除具有聚合酶活性外，还有3'→5'核酸外切酶活性，在DNA复制过程中能把错配碱基从3'端切除，然后换上正确配对核苷酸，具有校读功能；
   (2)DNA pol Ⅰ具有5'→3'核酸外切酶活性，能够从5'端切除DNA复制过程中合成的RNA引物，然后利用它的聚合酶活性填充剩下的空隙；
   (3)相当一段时间认为DNA损伤部位的切除靠DNA pol Ⅰ的作用，最近研究发现：原核生物靠Uvr蛋白，真核生物靠XP蛋白切除损伤部分，但DNA pol Ⅰ仍被认为是原核生物填充切除剩下空隙的酶。

原核生物有DNA pol Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，真核生物为DNA pol α、β、γ、δ、ε；而且每种酶都各有其自身的功能。
   另外，解螺旋酶，原核生物是Dna B基因的表达产物(Dna B)，真核生物就不可能是这个基因和这种产物。
   相同之处在于底物(dNTP)相同，催化方向(5'→3')相同，催化方式(生成磷酸二酯键)、放出PPi相同等。

真核生物线性染色体的两个末端具有特殊的结构，称为端粒(telomere)，它由许多成串短的重复序列组成，具有稳定染色体末端结构、防止染色体间末端连接和补偿复制过程中滞后链5'端引物RNA被水解留下的空缺，因端粒酶可外加重复单位到5'端上，以维持端粒的长度。
   端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它能以所含的RNA为模板来合成DNA的端粒结构。其中RNA链通常含有1个半拷贝的端粒重复单位的模板。端粒酶可结合到端粒的3'端上，RNA模板的5'端识别DNA的3'端碱基并相互配对．以RNA链为模板使DNA链延伸，合成一个重复单位后酶再向前移动一个单位。真核生物就是依靠端粒酶的这种爬行复制保证线性染色体的复制长度。

紫外线可以通过引起相邻的嘧啶二聚化而导致DNA结构的损伤，修复嘧啶二聚体的机制之一是由光复活酶催化的光复活修复，该反应机制是由可见光(最有效波长为400nm左右)激活光复活酶，接着由激活的光复活酶直接分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体，所以细胞在紫外线照射后暴露于可见光下比细胞保持在黑暗状态下更容易修复DNA，复活率也高。

通常分散在染色体上、与DNA损伤修复相关的酶和蛋白编码基因(SOS基因)被阻遏蛋白LexA封闭，SOS基因处于阻遏状态。当细菌在紫外线照射等刺激因子作用下，细胞内RecA蛋白被激活，而促进LexA自身的蛋白水解酶活性，催化LexA自身水解，SOS基因去阻遏，修复酶及相关蛋白质表达，SOS反应发生。

DNA的复制是重新产生、一种从头合成的过程，指通过完整染色体的两条链分别作为模板全被拷贝。
   DNA的修复合成是生物在校对因物理的或化学的因素引起的损伤时涉及，并局限在损伤的小范围内。
   DNA的复制和切除修复都需要模板和引物。在E.coli中，DNA的复制和切除修复都涉及DNA聚合酶Ⅰ(5'→3'外切酶活性和聚合酶活性)和DNA连接酶。

(1)同源重组：
   a．涉及同源染色体的同源序列间的联会配对。
   b．涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程。
   c．单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号。
   d．需要重组酶：RecA，RecBCD。
   (2)位点特异性重组：
   a．需要整合酶，不需ReeA蛋白。
   b．是一种保守重组。
   (3)转座重组：
   a．不依赖供体位点与靶位点间序的同源性(非同源重组过程，不依赖RecA蛋白)。
   b．转座插入的靶位点并非完全随机(插入专一型)。
   c．某些转座因子(Tn3)对同类转座因子的插入具有排他性(免疫性)。
   d．转座后，靶序列在转座因子两侧会形成正向重复。
   e．转座因子的切除与转座将会产生复杂的遗传学效应。
   f．转座需转座酶。

催化链交换反应的酶只能识别顺序高度相似的区域，并启动三链中间物的形成。在该中间物中，侵入的链与互补链进行碱基配对。如果两种DNA分子的顺序不同，这种配对则是不可能实现的。

首先，在靶位点处产生一个交错切口；接着，转座子与靶位点连接；最后，填补插入位点两侧的单链区。

E.coli DNA复制的起始需RNA聚合酶催化合成一小段RNA作为引物。利福平对RNA聚合酶具有抑制作用，对DNA聚合酶无活性，因此：
   (1)已经开始合成的所有DNA分子将会继续完成其复制过程，没有开始复制的DNA分子，不再起始复制。
   (2)由于氨基酸饥饿，在培养的初期，所有正在进行复制的DNA分子会继续完成其复制过程，但不会起始新一轮的DNA复制。以后加入必需氨基酸和利福平，由于利福平对RNA聚合酶的抑制效应，使得DNA复制起始所需要的RNA引物无法合成，DNA分子也无法进行复制。

子代DNA带相对于¹⁵N-DNA和¹⁴N-DNA带的位置反映出它的¹⁵N和¹⁴N的含量。如果DNA的复制是全保留的，那么在一次增殖后，一半的子代DNA由¹⁵N-DNA构成，另一半则为¹⁴N-DNA。换句话说，应该有两条子代DNA带，一条与亲代¹⁵N-DNA的位置相同，另一条与¹⁴N-DNA的位置相同。

DNA复制过程中，在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白质因子，它们在DNA链上形成离散的复合物，彼此配合进行精确的复制，这个结构叫做复制体。
   复制体主要的成分功能：
   (1)解螺旋酶或称解链酶：使复制叉前方的两条DNA母链解开；
   (2)单链结合蛋白(SSB)：稳定DNA解开的单链，阻止复制和保护单链部分免被核酸酶降解；
   (3)拓扑异构酶或称DNA螺旋酶：有效削弱螺旋状DNA结构解旋后产生的拓扑应力；
   (4)引物合成酶：以DNA为模板合成RNA引物；
   (5)DNA聚合酶Ⅲ：全酶二聚体的一个亚基与前导链模板结合，另一个亚基与形成一个环的后随链模板结合，发挥催化作用促使DNA新链合成；
   (6)DNA聚合酶Ⅰ：切除RNA引物，填补缺口；
   (7)DNA连接酶：连接相邻DNA片段的断口，形成两条连续的新链。

当DNA复制时，一条链是连续的，另一条是不连续的，称为半不连续复制；复制得到的子代分子，一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式叫半保留复制。

原核生物有三种DNA聚合酶，它们的活性如下表所示：

DNA聚合酶

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

5'→3'核酸外切酶 5'→3'聚合作用 3'→5'核酸外切酶

+ + +

- + +

+ + +

   各自的功能如下：DNA聚合酶Ⅰ的主要作用是修复和切除RNA引物；DNA聚合酶Ⅱ的主要作用是小短缺口修补，DNA聚合酶Ⅲ的主要作用是合成DNA。

(1)DNA双螺旋结构及碱基配对原则；
   (2)DNA聚合酶具有模板依赖性，复制时遵循碱基配对原则；
   (3)DNA复制过程中的错配修复机制；
   (4)DNA的损伤修复；
   (5)基因的回复突变；
   (6)密码子的简并性；
   (7)致死突变。

RNA聚合酶缺乏校对活性使得转录的错误率比DNA复制的错误率高，但所合成的有缺陷的RNA分子不可能影响细胞的生存力，因为：
   (1)从一个给定基因所合成的大多数RNA拷贝是正常的，有缺陷的蛋白质只占所合成蛋白质总数很小的百分比；
   (2)大多数RNA分子的半衰期很短，转录时产生的错误可很快被消除。

DNA复制时，首先需要将两条链解开，DNA聚合酶才能将它们作为模板，合成出各自的互补链，从而以半保留的方式形成两个子代分子。
   RNA转录时无需将DNA双链完全解开，RNA聚合酶能够局部解开DNA的两条链，并以其中一条链为有效的模板，在其上合成出互补的RNA链。
   SSB是单链结合蛋白，具有保护单链并防止恢复双链的作用。

DNA聚合酶：
   (1)需要提供合成模板；
   (2)不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'—OH，合成的方向是5'→3'；
   (3)除聚合DNA外还有其他功能；
   (4)以4种脱氧核苷三磷酸作为底物，需要适当浓度的二价阳离子和还原剂。
   RNA聚合酶：
   (1)需要提供合成模板；
   (2)无需引物；
   (3)无外切酶活性，没有校对功能；
   (4)合成的方向是5'→3'。
   逆转录酶：
   (1)需要提供合成模板；
   (2)需要引物；
   (3)以4种脱氧核苷三磷酸作为底物，需要适当浓度的二价阳离子和还原剂；
   (4)DNA链的延长方向是5'→3'。
   RNA复制酶：
   (1)需要模板；
   (2)4种5'-三磷酸核苷酸——腺嘌呤核糖核苷酸(A)、鸟嘌呤核糖核苷酸(G)、胞嘧啶核糖核苷酸(C)、尿嘧啶核糖核苷酸(U)为底物，需要适当浓度的二价阳离子；
   (3)没有校对功能；
   (4)RNA链的延长方向是5'→3'。
   通过比较可知其共同点。

这个实验是Meselson-Stahl实验的延续，它证明E.coli的复制是半保留的。按照半保留复制机制，在该实验条件下，第一代全是重DNA(¹⁵N-¹⁵N)，第二代应一半是重DNA(¹⁵N-¹⁴N)，第三代应1/3是重DNA，即重DNA相对轻DNA(¹⁵N-¹⁴N)的摩尔比为0.33。

(1)按照Watson-Crick模型，10个核苷酸对形成一个螺旋长0.34nm，所以E.coli DNA应含有：1100μm÷(3.4×10^-3μm)=3.24×10⁵个螺旋，3.24×10⁶个核苷酸对。
   (2)复制体的链增长速度为：3.24×10⁶核苷酸对/40min=81000核苷酸对/min。
   (3)复制的DNA分子旋转速度为：81000÷10=8100r/min。