简答题1. 列举三种真核生物转录因子中常见的DNA结合域,简要说明它们的结构特点。
①锌指基序组成DNA结合域:锌指包含约有23个氨基酸残基组成的环,它伸出锌结合位点,锌结合位点由半胱氨酸和组氨酸组成。锌指蛋白常有多个锌指,锌指的C端形成α螺旋,它结合一圈DNA大沟。②类固醇受体:是一组功能相关的蛋白质,每个受体都通过与一个特定的类固醇结合而被激活,它们的通用模式是,在结合小分子配体之前,这些蛋白质都处于失活状态。③亮氨酸拉链包括一连串氨基酸,其中每第七个为一个亮氨酸,两条肽链通过亮氨酸拉链相互作用,形成二聚体,与拉链相邻的是一段参与结合DNA的正电残基。
有如下两个大肠杆菌品系,请指出它们遗传基础的缺陷,并简述其机制:2. 在有无诱导物存在时均不能合成β-半乳糖苷酶;
可能的遗传机制包括:β-半乳糖苷酶基因突变、启动子突变、调节基因I发生超阻遏突变。
3. 表现组成型β-半乳糖苷酶的合成,当把F'i
+Z
-导入构成部分二倍体时仍能保留该组成型合成表型。
4. 画图说明一个操纵子的结构,标明转录(包括调控)和翻译的起始、终止序列的位置。
下面是两个操纵子相互关系的模式图。G,结构基因;O,操纵基因;E,酶;S,底物;P,产物;RG,调节基因。如果两种底物都存在,但S
1过量时,这一系统将出现什么样的反应?
当S1过量时,P1的合成将增加,与RG2所产生的阻遏物相互作用,关闭O2的作用,从而抑制E2的产生,使得从S2→P2的代谢受阻,进而使得O1操纵子的代谢顺利进行,产生充足的E1,促进S1→P1的代谢过程。
5. 比较真核生物和原核生物中控制基因转录的顺式位点的差异。
在原核生物中只有启动子是顺式调控位点,位于转录起始位点上游35碱基对之内。在真核生物中,启动子是顺式调控位点,位于转录起始位点70~80bp内;另外,增强子也是顺式调控位点,它位于基因的上游或下游,远离基因数千碱基对远。
6. 某一学者正在研究某一基因,该基因在雄性小鼠肾细胞中特异表达。他已经克隆了这个基因,希望鉴定出控制该基因组织特异性和性别特异性表达的DNA片段。请你提出一个合理的实验方案。
利用限制性内切核酸酶把该基因转录起始位点上游的不同片段切下,分别与—个具有启动子的报道基因、内含子、转录单位3′区域(含有多种突变但不影响转录和加工)重组,导入受精卵构建转基因小鼠。分析两种性别的不同组织和肾细胞中报道基因的表达。
7. 应用染色质免疫沉淀技术可以分离结合有DNA结合蛋白的DNA片段。如果你想知道在这些DNA片段中是否存在某一已知的DNA片段,你该怎么办?如果你用Lac阻遏蛋白的抗体进行染色质免疫沉淀实验,可以分离出多少不同的DNA片段?如果用pur阻遏蛋白的抗体呢?
可以利用分子杂交或PCR检测某一已知DNA片段的存在与否。Lac阻遏蛋白的抗体只能分离到一个DNA片段,pur阻遏蛋白的抗体可以分离出约20个不同的DNA片段。
8. 鉴定出一个新的蛋白质结构域,它可以识别双链DNA中的5-甲基胞嘧啶。含有该结构域的蛋白质在基因表达的调节方面有何作用?你预期这样的结构域在双链DNA的何处结合?
在一些不具有活性的启动子中,含有较多的5-甲基胞嘧啶,含有该结构域的蛋白质结合于其上,抑制启动子活性。甲基化基团位于双链DNA的大沟,因此该结构域也结合于此处。
9. Lac阻遏蛋白和pur阻遏蛋白具有同源性,三维立体结构也非常相似,然而对基因表达的影响却不同。试说出这两个蛋白质基因调节特性的两个主要差别。
Lac阻遏蛋白和诱导物结合后不能与DNA结合;pur阻遏蛋白只有在与小分子物质(共阻遏物)结合后才能与DNA结合。大肠杆菌基因组中Lac阻遏蛋白只有单一的结合位点,pur阻遏蛋白的结合位点有多个。
10. 一些化合物称为抗诱导物,它们可以与阻遏蛋白如Lac阻遏蛋白结合,从而抑制诱导物的效应,需要更高浓度的诱导物才能够诱导转录。请你提出抗诱导物的作用机制。
抗诱导物可以和阻遏蛋白结合,结合后的阻遏蛋白保持与DNA的结合能力;同时这种结合覆盖了诱导物与阻遏蛋白的结合位点,因此诱导物和抗诱导物竞争与阻遏蛋白结合。
11. 蛋白质组的复杂性远远大于基因组。请你说出其中的原因。
DNA重排、可变剪切、RNA编辑、蛋白的共价修饰、多蛋白加工。
预期DNA下列区域发生缺失的遗传学效应:15. 真核生物mRNA加工主要包括哪些步骤?
5′加帽、3′端加poly(A)尾、内含子的去除和外显子的拼接。
16. 真核生物的rRNA是如何加工的?
大部分rRNA是作为单一转录起始物的一部分合成的,经过加工才产生成熟产物。45S RNA前体中包括18S、5.8S和28S rRNA。成熟rRNA通过剪切和修正反应从前体释放。许多核酸酶参与rRNA加工,同时一组核仁小RNA也参与该过程。
17. 用含中性碳源(如甘油)的液体基本培养基培养E.coli不能诱导lac Z操纵子。1h后在培养基中加入乳糖和再隔一段时间加入过量的葡萄糖分别会对lac操纵子的表达有什么影响?
在最初的1h内没有诱导物(乳糖)的存在,所以lac操纵子是关闭的。加入乳糖后,因为没有葡萄糖,lac操纵子经诱导表达,使乳糖能够被利用,一段时间后加入的大量葡萄糖导致分解代谢阻遏使lac操纵子重新关闭。
18. 当P
+O
+lac Z
-或luc Y
-突变体生长在含乳糖的培养基上时,lac操纵子中剩余的基因没有被诱导,解释是何原因。
异乳糖是乳糖操纵子的天然诱导物,它是乳糖经过未诱导细胞中的少量β-半乳糖苷酶代谢产生的。在lac突变中完全不存在β-半乳糖苷酶,乳糖不能被代谢,在lac Z-中完全没有透性酶,因此乳糖不能进入细胞。这样,两种突变体中都不能产生异乳糖,因此操纵子中的其余基因都不能被培养基中的乳糖诱导表达。但是其他的基因能被像IPTG这样的安慰诱导物诱导,因为IPTG既能作为诱导物,又不需透性酶的帮助就能进入细胞。
19. 正调控和负调控的主要不同是什么?
负调控时,调节基因的蛋白质产物是基因活性的一种阻遏物;而在正调控时,调节基因的产物是一种激活物。
20. 哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?
-35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA聚合酶起始位点)启动子序列和终止子。
21. 举例说明原核生物启动子的结构与功能。
原核生物乳糖操纵子中启动子的结构是在-70到-50区有一个CAP结合位点,-50到-40区有一个CAP结合位点,这两个位点是CAP蛋白结合的位置;在-35区有一个σ因子识别的区域,-35区到-10区是RNA聚合酶结合的区域;-10区有一个pribnow框,该区保护DNA双螺旋的稳定性。
22. 简述互补实验怎样区别突变是发生在lac操纵子的结构基因上还是它的调控序列上?
把一个带有lac操纵子的F′质粒转化到一个F-的受体菌中,产生一个稳定的部分二倍体,其基因型为lac/F′lac。通过将不同的突变型导入这两个lac操纵子拷贝来研究互补关系。结构基因突变和调控基因突变两者之间重要的区别是:①大多数结构基因的突变仅影响该基因的表达而不影响操纵子内其他基因的表达。②调控基因的突变通常影响操纵子内所有结构基因的表达。③结构基因编码能够扩散的产物。④基因调控序列仅能起顺式作用。
23. 蜜二糖是lac操纵子的弱诱导物,它通常在自己的透性酶作用下进入细胞。但如果细胞在42℃下生长,透性酶失去活性,则蜜二糖只有在lac Y透性酶存在的情况下才能进入细胞。这样,42℃下lac Y
-和lac Z
-的突变株不能在以蜜二糖为唯一碳源的培养基上生长。如何通过这种特性分离lac操纵子的组成型突变?
42℃时,一个lac+诱导型菌株不能生长在含蜜二糖的培养基上。因为乳糖透性酶不能被诱导产生(细胞内既没有乳糖,也没有蜜二糖)。任何组成型的lac Oc和lac I-突变都能生长,原因是乳糖操纵子是永久性表达的,所以蜜二糖就能够被乳糖透性酶运入细胞内。
24. 什么是安慰诱导物?
安慰诱导物是一种与天然诱导物结构相似的化合物,它虽然能诱导操纵子表达,但是它不能被操纵子基因产生的酶分解。在lac操纵子中异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是乳糖的类似物,能代替异乳糖作为诱导物,但不能作为β-半乳糖苷酶的底物进入代谢途径。
25. 葡萄糖如何影响涉及糖代谢的操纵子(葡萄糖敏感型操纵子)的表达?
在缺乏葡萄糖时,cAMP的水平升高,CAP蛋白同每一个葡萄糖敏感操纵子中启动子内的CAP位点结合,转录作用协同起始。如果有葡萄糖,cAMP的水平下降,CAP蛋白不再结合,转录的速率协同下降。
26. 在大多数细菌操纵子中,结构基因通常紧靠在一起并由单个操纵序列——启动子区调控,而在一些例子中结构基因分散在染色体上。请问这些基因是如何以简单的方式达到协同调节的。
每一个结构基因都有它自己的启动子和通用的操纵基因序列。
27. 如何区分由启动子起始转录的RNA片段与5′端被加工过的RNA片段;
转录中,5′核苷三磷酸聚合到RNA链的3′-OH端,该过程包括释放焦磷酸(即两个磷酸基)和形成磷酸二酯键。因此,只有5′端第一个核苷酸会有三磷酸基团。若RNA被加工,则5′端的核苷酸会被取代,剩下核苷单磷酸末端。
28. 证明多肽是从氨基端到羧基端方向合成的。
让E.coli细胞与14C标记的甲硫氨酸(或其他标记氨基酸)共培养,该氨基酸只被掺入延伸中多肽的末端。提取多肽进行检测,标记物能显示最后合成的区域。研究发现羧基端往往有很高浓度的标记,而氨基端很低。
29. 列举一个已知的DNA序列编码一种以上蛋白质的三种方法。
①可读框中在核糖体结合位点之后含有多重起始位点;②以一两个碱基的移码方式出现重叠的可读框;③不同的剪接方式,例如,选择不同的外显子组合成不同的mRNA;④蛋白质翻译后的加工切割。
30. 甾醇类转录因子与锌指蛋白类转录因子的区别是什么?
类固醇受体与锌以Cys-Cys-Cys-Cys基序相结合,而锌指蛋白使用Cys-Cys-His-His基序。
31. 什么是增强子?与其他调控序列相比,增强子的调控有什么特点?
增强子指可以增强邻近结构基因转录的序列。其特点是:①可以与所调控转录的基因距离几千个碱基;②可位于基因的上游或下游;③作用时无方向性,因而能同时影响两侧两个基因的表达;④必须与受调控的基因位于同一DNA分子中,但可位于任一条DNA链上;⑤没有基因特异性,增强子可激活两侧的任一基因;⑥有组织特异性;⑦优先作用于最邻近启动子的转录;⑧与增强子结合的蛋白质包括激素受体蛋白。
32. 对于下列的各个大肠杆菌二倍体来说,请指出在添加和不添加诱导物时其β-半乳糖苷酶和透过酶是否是可诱导的或者组成型的或者是负的。
(1)i
+O
-Z
-Y
+/i
+O
cZ
+Y
+ (2)i
+O
cZ
+y
-/i
-O
cZ
-Y
- (3)i
-O
+Z
-Y
+/i
-O
cZ
+Y
+ (4)i
+O
cZ
-Y
-/i
-O
cZ
-Y
- (5)i
-O
+Z
+Y
-/i
+O
cZ
-y
-
假设R基因编码的蛋白质是S基因转录的负调控子。试问:33. 在R
-突变体中S基因是否转录?
由于是负控制,阻遏蛋白(或者复合物)与DNA的接合使原本转录的基因停止。所以R发生突变变成R-使得阻遏蛋白不能表达或者构型发生变化,不能与DNA结合,S基因转录。
34. 如果R基因产物是S基因转录的正调控子,结果又有什么不同?
与负控制相反,正控制子与DNA结合则启动相关基因的表达,R-不能产生正常结构的蛋白质(激活子),不能与DNA结合,不能启动相关基因的表达,所以S基因不转录。
35. 你已经克隆了一个基因,该基因在雄性小鼠的肾细胞中特异表达。如果想知道与该基因组织特异表达和性特异表达有关的DNA片段,你应该如何设计实验呢?
构建一系列的报道基因重组体DNA,包括启动子上游DNA片段的各种改变、该基因的启动子、报道基因,以及该转录单位的3′端区域。然后制作转基因小鼠,分析两种性别中各种组织和肾组织中报道基因的表达。