目的基因的获取；载体的选择；目的基因和载体用相同的限制性内切酶酶切；(酶切产物的回收)；目的基因与载体的连接；重组DNA的转化；阳性重组子的筛选和验证。

β-半乳糖苷酶由4个相同亚基组成，每一个亚基都由位于同一条多肽链上的功能互补的α小片段和ω大片段组成。在经过基因改造的只表达叫大片段的菌株中转入表达α小片段的质粒，可以产生具有半乳糖苷酶活性的复合物，这种现象称为α互补。在质粒的α小片段编码区中插入一个多克隆位点，如果在多克隆位点中插入了外源DNA片段，就会造成α小片段功能的丧失，不能产生有活性的半乳糖苷酶复合物，在含有IPTG和X-gal的平板上克隆的颜色为白色，表明克隆为重组克隆；否则，能够产生有活性的半乳糖苷酶复合物，可以分解X-gal使其显示蓝色，在平板上长出的克隆为蓝色，表明克隆为非重组克隆。

a．转化后涂板时，应加入Kan筛选转化子。
   b．培养后长出的克隆的抗性基因型是Amp^r/Kan^r和Amp^s/Kan^r。
   c．首先将转化后的菌液涂在含有Kan的平皿上，然后将长出的克隆一一对应地挑取到含有Amp的平皿上，在Kan平皿中生长而在Amp平皿中不长的菌落即为含有插入片段的重组质粒，其抗性基因型是Amp^s/Kan^r。

RNA降解通常是RNA酶造成的，污染可能来源于组织或细胞本身的内源RNA酶，或者来源于浮尘及飞沫的外源RNA酶。
   改进方法：①在提取RNA的时候佩戴手套和口罩，所用试剂和器具都要经DEPC处理或高温灭菌处理以防止外源RNA酶污染；②冻存的组织或者细胞样品需要保存在-70度，新鲜样品或者解冻样品应该立即处理，以免释放内源RNA酶造成RNA的降解；③不要使用过量的RNA样品，以免裂解不充分，造成内源RNA酶的污染；④制备的RNA样品需要保存于-70度。

可以用无RNA酶的DNA酶处理RNA样品，降解去除其中的基因组DNA污染。
   如果待扩增的目的基因编码区中含有较长的内含子，可以导致基因组DNA不能在PCR反应的时候得到有效扩增，则可以不用在意基因组的污染。

不可以。使用基因特异性引物只能获得目的基因的cDNA，无法得到包括作为基因表达定量分析的内标在内的其他基因的cDNA，因此无法进行下一步目的基因表达的定量分析。

不可以。因为用自来水配制的琼脂糖凝胶没有缓冲液成分，不能导电，会导致DNA分子在凝胶中的迁移速度极慢，无法实现样品DNA的分离。
   必须使用电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，为电泳提供一定的离子强度，并保持较稳定的pH值。

溶液Ⅰ主要成分是含有葡萄糖和EDTA的缓冲溶液，主要作用是提供等渗缓冲液使细胞充分分散成单细胞悬液。
   溶液Ⅱ主要成分是含有SDS的NaOH溶液，主要作用是破碎细胞，使释放出来的染色体DNA和蛋白质完全变性。
   溶液Ⅲ主要成分是酸性的乙酸钾一乙酸溶液，主要作用是中和溶液Ⅱ，使溶液恢复中性，质粒DNA快速复性，以可溶形式存在于上清液中，同时提供K⁺置换SDS中的Na⁺，生成不溶性的PDS，有效沉淀细菌蛋白质、细胞壁组分和变性的染色体DNA复合物。

苯酚极易被氧化，8-羟基喹啉是抗氧化剂，可以保护苯酚；另外苯酚无色，加入8-羟基喹啉后呈淡黄色，可以作为指示剂使苯酚与水区分，并指示苯酚是否被氧化，如淡黄色消失则说明苯酚被氧化，不可再用。

限制性内切酶在非标准反应条件下会产生星号活力，即对底物识别的特异性降低，识别切割与其特异性识别序列类似的其他DNA序列。如果酶切反应体系中甘油浓度过高(体积分数＞5%)、酶的使用量过多、盐离子浓度比较低(＜25mmol/L)、pH高于8.0均会诱导酶的星号活力，因此在使用DNA限制性内切酶时，应保证酶的使用量不超过反应总体积的1/10(以使甘油浓度不超过5%)；尽量在中性pH和高盐浓度下进行反应。

(1)可先选择在低盐条件下活性较高的内切酶进行单酶切，然后在反应体系中补加适当的盐离子，提高盐浓度，再加入在高盐条件下活性较高的内切酶进行第二个酶的酶切反应。
   (2)依次进行酶切，第一个酶切完成之后通过DNA回收试剂盒或者乙醇沉淀的方法分离DNA，更换缓冲液进行第二次酶切。

主要优点：大肠杆菌遗传背景清楚、生长繁殖快、培养成本低、操作简单、蛋白质表达量高、表达产物易纯化等。
   主要缺点：缺乏蛋白质的翻译后加工系统、表达产物容易形成包含体、
   大肠杆菌本身含有的内毒素等可能混杂在蛋白质表达产物中等。

GST融合表达的优点是：①GST可以促进目的基因的可溶性表达；②GST与还原型谷胱甘肽(GSH)特异性结合，因此可以用偶联了GSH的琼脂糖凝胶介质进行亲和纯化；③GST具有酶活性，可以利用试剂盒进行检测，从而直接反映融合蛋白的可溶性表达量。
   缺点是：GST分子质量较大(26kD)，需要在融合蛋白表达纯化后，通过化学试剂或蛋白酶切割去除，以释放并纯化目的蛋白。
   His-tag融合表达的优点是：①His-tag由6个组氨酸组成，相对分子质量很小，一般认为不会对融合表达的目的蛋白的结构和功能产生影响，因此不需要在后期切除；②His-tag与多种过渡金属离子如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺有较强的亲和作用，因此可以用偶联了Ni²⁺的琼脂糖凝胶介质进行亲和纯化。
   缺点是：His-tag对目的蛋白的可溶性表达并无帮助。

合适的蛋白质相对分子质量标准(marker)(样品1)；转入相应的空质粒(非重组质粒)的大肠杆菌在非诱导和诱导状态下的全菌总蛋白质(样品2、3)；转入重组质粒的大肠杆菌在非诱导状态下的全菌总蛋白质(样品4)；在诱导状态下的全菌经超声裂解、高速离心后的上清及沉淀(样品5、6)；如果条件允许，可以准备目的蛋白的标准品(样品7)。这样SDSPAGE的结果可以帮助判断重组质粒中的目的蛋白在大肠杆菌中是否表达、是否诱导表达以及是否可溶性表达。

在甲醇或乙醇中浸泡的目的是使PVDF膜水化，不能省略。PVDF膜具有极强的疏水性，直接放在转膜缓冲液中浸泡无法使其水化，必须经过甲醇或乙醇的浸泡处理，使其从白色转变为均匀的半透明状后，才能与蛋白质结合。

报告基因是一类表达产物易于检测、且易与内源性蛋白质相区别的基因，用于鉴定细胞、组织对外源刺激的应答，或者鉴定DNA顺式作用元件的调控作用。
   理想的报告基因应具备以下几点条件：①报告基因产物必须能与转染前细胞内的任何相似的基因产物相区别；②细胞内其他的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；③报告基因产物的表达不会影响细胞的生理活动；④报告基因产物的检测方法必须快速、简便、灵敏、重复性好、线性范围宽；⑤报告基因产物的含量能实时反映报告基因的转录活性状态。

酵母双杂交将目标蛋白以及待筛选蛋白的表达质粒同时转入酵母细胞中高表达，这样筛选到的相互作用的蛋白质，在真实细胞中可能由于两种蛋白质的表达时间或者表达部位不同而并不存在相互作用，也可能在真实细胞中表达量很低而不发生相互作用，因此可能出现假阳性结果。

选择内参最主要的要求是作为参照基因，应该在实验条件下，表达水平在实验组和对照组中基本一致。另外不能与检测基因有交叉反应，便于与检测基因的检测结果进行区分。

检测RNA结合蛋白或DNA结合蛋白分别使用标记的RNA探针和DNA探针，为了避免探针的降解，要防止核酸酶、磷酸酶的污染。尤其是RNA酶广泛存在，因此抽提液、结合缓冲液等都需要RNase-free处理。

可通过加入p65特异性抗体，观察抗体-结合蛋白-核酸探针形成的超复合物在凝胶电泳中的迁移率是否进一步降低(supershift)来确定p50/p65异源双聚体的存在。