因为甲醛交联后的染色质中的DNA与核小体结合，酶切位点被覆盖，不能被限制性内切酶或DNaseⅠ切割。

免疫共沉淀研究的蛋白质是在真核细胞中表达并经过翻译后修饰的蛋白质，可以研究在完整细胞中内源性蛋白质之间的相互作用(内源IP)，或者通过转染表达质粒提高目的蛋白质在细胞中的含量而研究低丰度蛋白质之间的相互作用(外源性IP)，免疫共沉淀一般用于验证已知蛋白质之间的相互作用，很少用于筛选新的相互作用。
   GsT pull-down是将GST作为融合标签帮助诱饵蛋白固定在琼脂糖磁珠上，从多种蛋白质的混合液中钓出与之相互作用的猎物蛋白，可以研究蛋白质在体外的相互作用，一般用于筛选与诱饵蛋白相互作用的新蛋白。

分析时，在荧光2宽度(Fluorescence2-Width，FL2-W)对荧光2面积(Fluorescence2-Area，FL2-A)二维点图上设“门”，去除FL2-W的值大于200的点，以排除细胞聚集体及细胞碎片的干扰(示意如图)。
   

早期凋亡细胞：细胞膜完整，但是正常位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)发生外翻，暴露到细胞膜外表面。在利用流式细胞仪检测时，核酸染料碘化亚锭(PI)不能透过完整的细胞膜，因此早期凋亡细胞不能与PI结合，显示PI^-；但是与PS有高亲和力的annexin V可以与早期凋亡细胞表面的PS结合，因此早期凋亡细胞可以与被荧光素FITC标记的annexin V结合，显示annexin V-FITC⁺。因此早期凋亡细胞在进行annexin V-FITC和PI双染时显示FITC⁺/PI^-。
   晚期凋亡细胞：细胞膜会发生内陷，包裹内容物形成凋亡小体。在利用流式细胞仪检测时，会有一部分的PI被包裹渗透到细胞内，显示PI⁺；因此晚期凋亡细胞在进行annexin V-FITC和PI双染时显示FITC⁺/PI⁺。

①提取该酵母菌株的基因组DNA；
   ②选择适当的DNA限制性内切酶切割获得的基因组DNA；
   ③选择适当的载体并用同一种DNA限制性内切酶切割；
   ④将用同一种DNA限制性内切酶切割的载体与基因组DNA片段连接；
   ⑤转化大肠杆菌或酵母细胞；
   ⑥筛选阳性克隆。

①cDNA文库中不含内含子对应的序列；
   ②cDNA文库中不含基因组中存在的内源性启动子序列；
   ③因为存在可变拼接，所以同一基因可能会产生多个cDNA序列；
   ④cDNA文库中不含在制备cDNA文库的细胞中不表达的基因。

参见下图。
   

同源建模又称为比较建模，其原理是序列相似则结构相似，即存在同源关系的两条序列具有相似的结构。同源建模是指寻找与目标序列同源而且有实验测定结构的蛋白质作为模板，从而构建目标序列结构的方法。其一般步
   骤为：
   ①搜索同源蛋白质结构，序列相似性一般＞30%；
   ②得到目标序列和模板序列最可能的完整比对；
   ③以模板结构骨架作为模型，建立目标蛋白质骨架模型；
   ④在空位区域，使用环建模过程代替合适长度的片段；
   ⑤给骨架模型加上侧链；
   ⑥优化侧链的位置；
   ⑦使用能量最小和其他优化方法优化结构。

(1)二维电泳：分别提取肿瘤组织与癌旁正常组织的总蛋白质，进行二维电泳，找出差异点，通过质谱鉴定差异蛋白质。
   (2)cDNA芯片：分别提取肿瘤组织与癌旁正常组织的总RNA，与cDNA芯片杂交，鉴定表达量有变化的mRNA。
   (3)差显PCR：分别提取肿瘤组织与癌旁正常组织的总RNA，逆转录获得cDNA，再利用poly(dT)和随机引物进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳分析，鉴定差异条带。

Cre/loxP系统是条件型基因敲除中常用的定位重组系统，包括Cre重组酶和loxP位点两部分。Cre酶是从P1噬菌体中发现的，属于λInt酶超基因家族，由343个氨基酸组成，是38kD的单体蛋白。
   laxP(locus of x-over P1)序列来源于P1噬菌体，由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了loxP的方向。其序列如下：
   5'-ATA ACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'
   3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'
   Cre酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个loxP位点(序列)之间的特异性重组，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。

质粒的大小为5Kb。酶切位点参见下图。
   

(1)首先需要获取该蛋白质的基因序列：
   对该蛋白质N端或C端进行部分测序；根据氨基酸序列反推其mRNA
   序列；根据mRNA设计引物；从猪皮肤组织中提取总RNA或mRNA，逆转录得到cDNA；从cDNA中扩增该蛋白质的编码序列。
   (2)对该基因序列进行分析，寻找其同源蛋白，尽可能多地了解其
   背景：
   相对分子质量、氨基酸组成、半胱氨酸和二硫键的数目、是否是糖蛋白、是否多亚基蛋白等。
   (3)选择合适的体外表达体系：
   如果为分子质量适合(5～60kD)、二硫键不多(＜2对)、没有糖基化等化学修饰的单体蛋白质，则可以考虑在大肠杆菌体系中表达；如果结构复杂、有糖基化修饰则需要选择真核表达体系。

①通过RT-PCR或Realtime RT-PCR检测D作用于肿瘤细胞Can后，细胞中Gen基因的转录水平的变化，即mRNA含量的变化：根据Gen基因的序列设计RT一：PCR或．Realtime RT—PCR的引物；检测不同浓度的药物D作用于肿瘤细胞Can一定时间后(一般6～8小时)，细胞中Gen基因的mRNA水平变化；检测特定浓度的药物D作用于肿瘤细胞Can不同时间后(一般0～24小时)细胞中Gen基因的mRNA水平变化。
   ②通过Western blotting检测D作用于肿瘤细胞Can后，细胞中Gen基因的翻译水平的变化，即蛋白含量的变化：利用Gen蛋白特异性的抗体，检测不同浓度的药物D作用于肿瘤细胞Can一定时间后(一般24小时)，细胞中Gen蛋白水平的变化；检测特定浓度的药物D作用于肿瘤细胞Can不同时间后(一般为0～48小时)，细胞中Gen蛋白水平的变化。

(1)可以通过GST pull-down实验验证与GST融合表达的X能否将细胞裂解液中的Y一起沉降，或者验证与GST融合表达的Y能否将细胞裂解液中的X一起沉降。
   (2)可以通过免疫共沉淀技术，验证X的特异性抗体能否将细胞裂解液中的Y一起沉淀，或者验证Y的特异性抗体能否将细胞裂解液中的X一起沉淀。一般先进行外源性IP，即通过X和Y真核表达质粒的共转染或单独转染，进行两种蛋白质均过量表达或一种蛋白质过量表达情况下的外源性IP，成功后再进行内源性IP，即不转染任何质粒，两种蛋白质均为细胞内正常浓度下的IP。

构建该镉结合蛋白N端与供体荧光蛋白CFP、C端与受体荧光蛋白YFP融合的重组表达质粒，转染细胞。如果环境中存在重金属镉，则重组蛋白与镉结合，肽链折叠使N端与C端相互邻近，则供体荧光蛋白CFP与受体荧光蛋白YFP相互邻近，发生FRET；如不存在重金属镉则没有FRET发生或FRET效率很低。

在后缘FRET实验中，当转录起始过程结束时，如果σ因子与核心酶发生解离，离开核心酶，则FRET效率降低；如果σ因子与核心酶不发生解离，则σ因子会跟核心酶一起向DNA下游移动，同样会导致FRET效率降低。因此在后缘FRET实验中，随着转录的进行，FRET效率降低。后缘FRET实验无法区分在转录起始结束时σ因子是否与核心酶发生解离。
   在前缘FRET实验中，当转录起始过程结束时，如果σ因子与核心酶发生解离，离开核心酶，则FRET效率降低；如果σ因子与核心酶不发生解离，则σ因子会跟核心酶一起向DNA下游移动，而导致FRET效率升高。因此在前缘FRET实验中，随着转录的进行，FRET效率升高。证明在转录起始结束时，σ因子并未与核心酶解离。

不正确。就他目前所做实验无法得出上述结论，原因是该学生设计的实验都没有先验证真核表达质粒或者RNA干扰质粒的转染效率(可以通过共转染荧光蛋白表达质粒，然后使用荧光显微镜进行观察)；也没有验证真核表达质粒在细胞内表达PKX的效率或者RNA干扰质粒在细胞内干扰PKX的效率(可以通过Western blotting验证PKX的表达水平)。

图b中泳道1～4分别为细胞裂解液中诱饵蛋白的表达量，其中1～3泳道反映诱饵蛋白Flag-FADD、Flag-FADD-DED、Flag-FADD-DD表达量相当，泳道4因为Fllag的相对分子质量较小，不在检测范围内，所以未见条带。
   泳道5～8分别为各组co-IP实验的上清液，可见泳道5～7中各诱饵蛋白的含量均显著下降，因为抗Flag的抗体将各组诱饵蛋白“沉淀”(与磁珠结合)了，同泳道4的原因，泳道8未见检测条带。
   泳道9～12分别为各组co-IP实验的“沉淀”(与磁珠结合)部分，可见泳道9～11中均有各诱饵蛋白，同理泳道12未见检测条带。
   图a中泳道1～4分别为细胞裂解液中目标结合蛋白的表达量，可见各组实验中HA-Fas的表达量相当。
   泳道5～8分别为各组co-IP实验的上清液，可见泳道5和7中HA-Fas的含量显著下降，说明它们分别通过与诱饵蛋白Flag-FADD和Flag-FADD-DD的相互作用而被“沉淀”(与磁珠结合)了，相比之下泳道6和8中HA-Fas的含量并未减少，说明它们未与诱饵蛋白Flag-FADD-DED和对照组中的Flag结合。
   泳道9～12分别为各组co-IP实验的“沉淀”(与磁珠结合)部分，可见泳道9和11中均有目标蛋白HA-Fas，说明诱饵蛋白F1ag-FADD和Flag-FADD-DD可以与HA-Fas相互作用而发生共沉淀，泳道10、12中则未检测到目标蛋白HA-Fas，说明诱饵蛋白Flag-FADD-DED和对照组中的Flag不能与HA-Fas相互作用。
   综上所述，FADD通过DD结构域与Fas相互作用。