C

B

D

C

C

A

D

B

D

B

超螺旋结构，开环双螺旋结构，线状双螺旋结构

复制的起始区，选择标记基因区，多克隆位点

细菌，选择标记，真核生物，选择标记，克隆，扩增克隆，基因表达分析

扩增，表达

染色体，自主，环状双链

插入，置换，切除载体的一个片段

反转录，RNA，聚合反应

置换合成法，自身引物合成法，引导合成法

禽成髓细胞性白血病病毒，莫洛尼鼠白血病病毒

愈伤组织再生系统，直接分化再生系统，原生质体再生系统，胚状体再生系统，生殖细胞受体系统

A

B

[解析] 终止子是指转录的终止信号，而终止密码子是翻译的终止信号。

A

A

A

A

B

[解析] 这种转移DNA(transfer DNA，T-DNA)序列一般只存在于根癌农杆菌中。

A

A

A

①将克隆转移到一张硝酸纤维素膜或尼龙膜上；②用碱处理使细胞中的DNA释放出来并且发生解链；③然后通过烘烤或紫外线照射将DNA固定在膜上；④将转好的膜在含有探针的杂交液中杂交，使得探针与目标DNA紧密结合，漂洗后将非特异结合的探针去掉；⑤探针被地高辛标记时，可以通过抗体和地高辛的二次杂交和显色反应在含有特定DNA片段的克隆对应位置出现紫色印记，如果探针被同位素标记，可以通过放射自显影使得X光片感光而在相应位置出现感光信号。

①将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中；②采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题；③构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。

基因工程要解决的问题是把天然存在的蛋白质通过克隆基因大量地生产出来；蛋白质工程则致力于对天然蛋白质的改造，制备各种定做的新蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。

蛋白质工程是在基因工程、生物化学、分子生物学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有：①根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；②确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；③从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。

T-DNA的转录的共同点有：①T-DNA的两条链都是有意义链，即都能被转录。②T-DNA上每个基因都有各自的启动子。③基因的转录由植物细胞RNA聚合酶Ⅱ完成。④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，在其5'端转录起始处有TATA盒和CAAT盒。同时AATAAA加尾信号也在同一条链上发现，故T-DNA的转录机理可能与真核生物相同。⑤植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。

①同聚物加尾：利用末端脱氧核苷酸转移酶在DNA分子3'-OH加上一系列同种脱氧核苷酸。一般采用cDNA加上oligo(dC)，载体加上与之互补的oligo(dG)，两分子按着黏性末端连接。形成重组体时还需要连接酶及Klenow片段补平因尾长短不一出现的缺刻。②加接头：接头是人工合成的8～12bp双链平端片段。片段中含有一个产生黏性末端的限制酶位点。利用T4 DNA连接酶先将衔接体连接到cDNA平端(非平端可通过Klenow补平)，然后再用限制酶消化，产生黏性末端的cDNA。③加衔接子(adaptor)：衔接子也是人工合成的短的双链DNA片段。与接头不同的是其一端为平端(供与平端cDNA连接)，另一端是已形成好的限制性酶切的黏性末端(供与载体相连)，但5'端无磷酸基团。

主要有：①病毒介导的基因表达；②外源基因在哺乳动物细胞中的稳定表达；③外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达；④转基因动物；⑤核酸免疫。

基因打靶指通过DNA定点同源重组，改变基因组的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能，它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术的成就之上。在小鼠中进行基因打靶，其作用有：①完全基因剔除；②基因捕获；③精细突变的引入；④研究基因活动的调控机制等。

基因敲除指一个有功能的基因通过基因工程方法完全被剔除的人工突变技术。人为地将小鼠的某一种有功能的基因完全缺失的技术就称为基因敲除技术。这项技术是M. Capecchi于20世纪80年代末在Utah大学发展起来的。实验的动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠(knockout mice)。基因敲除技术已成功地应用于几种遗传病的研究，还可用于研究特定基因的细胞生物学活性及研究发育调控的基因作用等，因此是研究基因功能的一项非常有用的技术。基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。

大肠杆菌作为基因工程表达菌的特点有：
   (1)原核细胞有其固有的RNA聚合酶，该聚合酶和真核细胞的RNA聚合酶不同，不能识别真核基因的启动子序列。因此，在用原核细胞表达真核基因时，一般应使用原核启动子。如果能在原核细胞表达真核细胞的RNA聚合酶，则可以在该细胞中用真核启动子来表达真核基因。
   (2)原核基因的mRNA含有SD序列，SD序列位于mRNA的5'端起始密码子的上游，能够和16S核糖体RNA 3'端互补结合，在真核细胞基因上则缺乏该序列。
   (3)真核基因往往有内含子(intron)，转录后的mRNA前体经剪接成为成熟的mRNA。原核细胞则缺乏mRNA转录后加工的能力。因此，在原核细胞中表达真核基因，目的基因必须无内含子序列，一般用mRNA反转录而成的cDNA作为目的基因。
   (4)原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力，如不能进行糖基化、不能进行正确的折叠等。
   (5)外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包含体(inclusion body)。包含体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包含体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包含体蛋白。包含体蛋白不具有该蛋白质的所有生物学活性。
   (6)在大肠杆菌中表达外源蛋白质缺乏将外源蛋白质释放到培养基中的有效分泌机制。

利用杆状病毒可以在昆虫细胞内表达外源基因。其主要特点有：
   (1)和大肠杆菌不同，昆虫细胞是真核系统，具有真核细胞表达的优点，可以对重组蛋白进行一系列的翻译后修饰。
   (2)由于可以用高滴度的重组杆状病毒感染昆虫细胞，因此可以较容易获得大量重组蛋白。
   (3)在昆虫细胞中表达的重组蛋白大部分是可溶性蛋白，不像在大肠杆菌中表达的蛋白质往往是包含体。
   (4)可以容纳较大的外源基因表达。
   (5)杆状病毒的核多角体启动子是目前发现的最强的启动子之一，在其控制下的外源基因可以得到高效表达。
   (6)杆状病毒不能感染脊椎动物，杆状病毒的启动子在哺乳动物细胞内失活，因此操作较安全，可以用来表达癌基因和其他潜在的毒蛋白。
   (7)如果使用核多角体基因进行同源重组，由于病毒感染细胞内的包含体消失，可以在光学显微镜下筛选重组病毒，而哺乳动物细胞的筛选工作复杂且费时。
   (8)昆虫细胞具有不完全的RNA剪接功能，一些含有内含子的DNA序列，如一些从RNA病毒基因反转录而来的cDNA，可以在昆虫细胞内得到表达，如用建立哺乳动物细胞系的方法，则不易得到正确表达。
   (9)和其他真核细胞表达系统相比，杆状病毒表达系统的最大特点就是高水平表达外源基因。最高表达时，重组蛋白可以占细胞总蛋白的50%。