二、简答题1. 设计PCR引物的基本原则?
(1)一对引物，与3'端互补。
(2)长度：15～30个核苷酸。
(3)碱基分布随机。
(4)引物内、引物间尽量避免互补序列。
(5)引物与非特异扩增区无同源性。
(6)3'端必须互补，5'端可游离(可添加酶切位点或保护碱基)。
2. 何谓RNAi和microRNA?两者在概念和应用上有何区别?
RNAi即RNA干扰(RNA interference)，指利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型的技术。与基因敲除不同，RNA干扰导致的基因活性下调一般是不完全的，所以又称为knock-down。
microRNA一般在生物体内行使基因调控功能。产生于细胞内的非编码茎环结构被Dicer剪接成21-22nt的短链，形成成熟的microRNA。成熟的microRNA与microRNP核蛋白复合体结合，识别靶基因mRNA并与之结合互补成双链分子，最终造成双链分子降解，从而阻碍靶基因mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链microRNA与蛋白复合物microRNP结合引导复合物通过部分互补结合到mRNA的3'UTR区，阻止翻译。
区别：RNAi技术是基于外源的双链小RNA分子对靶标mRNA进行降解，而microRNA是内源产生的，围绕microRNA的技术一般也是基于对内源microRNA能的调控来实现对靶标基因mRNA的调节。
3. 何谓蛋白质组学?在技术上有何特点?
(1)蛋白质组(proteome)是指一种基因组所表达的全套蛋白质，包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白屯蛋白相互作用，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。基于蛋白质组的研究学科就是蛋白质组学(proteomics)。
(2)蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究手段通常是高通量快速的自动化系统配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。核心技术是双向电泳和质谱。
4. 举例说明研究蛋白质间相互作用的实验方法及其作用原理?
研究蛋白质间相互作用(protein-protein interaction)的方法有很多，可分为体内和体外两大类，这里只列举部分方法。
(1)体内(in vivo)研究方法：
1)酵母双杂交体系。利用真核生物转录调控因子的组件式结构特征，将DNA结合结构域(BD)与转录激活结构域(AD)分开融合到两个不同的蛋白上，当两个蛋白发生相互作用，BD和AD起作用，激活下游报告基因转录。该技术可用于筛选与靶蛋白相互作用的未知蛋白。
2)荧光共振能量转移(FRET)。当供体荧光分子荧光光谱与受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象称为荧光共振能量转移。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，随着距离延长而减弱。利用这项技术可以检测细胞内两个蛋白间是否有相互作用。
(2)体外(in vitro)研究方法：
1)Far Western印迹技术。一种基于western blotting的一种分子生物学方法。使用常规放射自显影技术，而不是抗体标记，可以检测能够与目标蛋白结合的非抗体蛋白质。
2)GST融合蛋白沉降技术。利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合样品中纯化得到相互作用蛋白。可用于确定探针蛋白与未知蛋白的相互作用，也可用于证明探针蛋白与已知蛋白的相互作用。
3)蛋白质芯片技术。大规模筛选蛋白互作的技术。
4)免疫共沉淀技术(Co-IP)。利用抗原抗体结合特性而发展的一门技术。抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。
5. 举出4种常用的分子生物学基本实验技术，并说明其作用?
分子生物学实验技术有很多，这里列出五种供参考。
(1)凝胶电泳，以DNA样品检测或鉴定为例，最常用的方法就是通过凝胶电泳观察条带。利用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制成一定浓度的凝胶，将DNA样品分孔道点入后，在电流作用下DNA由负极向正极移动。不同大小的DNA移动速度不同，用溴化乙锭(EB)染色之后放置在紫外光下观察，与标准样品(marker)比较后便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位。此法可用于PCR产物和酶切产物等DNA样品的鉴定，也可用于DNA纯化。
(2)Northern blotting杂交技术，这是较为传统的实验方法。用DNA探针检测特异序列的RNA。首先从待研究组织或细胞中提取全RNA，在变性琼脂糖凝胶电泳中分离，再把RNA条带转移到纤维膜上，进行一定处理后用32P探针与膜杂交，放射自显影检测特定RNA条带。此方法主要检测特异mRNA分子大小及表达量，以分析细胞生长发育过程中特定基因的作用。
(3)PCR，全称为polymerase chain reaction，即聚合酶链式反应。这是现代分子生物学中基因扩增最常用技术之一。利用两种寡核苷酸引物分别与特异性DNA区段的正链和负链末端互补，经过模板DNA变性，模板DNA—引物的配对，在DNA聚合酶作用下发生引物延伸反应，3个反应阶段后生成新的子代DNA双链。多次循环后可得到大量目标DNA片段。
PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高对原始材料的质和量要求低的特点，使得PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于各个领域，如基因克隆、疾病诊断、新子鉴定等。
(4)酵母双杂交体系。利用真核生物转录调控因子的组件式结构特征，将DNA结合结构域(BD)与转录激活结构域(AD)分开融合到两个不同的蛋白上，当两个蛋白发生相互作用，BD和AD起作用，激活下游报告基因转录。该技术可用于筛选与靶蛋白相互作用的未知蛋白。
(5)染色体步移法。与目标克隆基因连锁近遗传标志出发，以其为探针在基因组文库中筛选片段，阳性克隆末端的限制性片段进而被用做探针从基因组中筛选重叠区域。反复操作后即可实现在染色体上“步移”到目标基因的准确位点。这项技术称为染色体步移技术。染色体步移技术可以实现从已知最近位点(EST或其他连锁基因)克隆基因，获取新物种中基因的非保守区域从而获得完整的基因序列，或鉴定插入位点。
三、论述题1. 如何克隆一个基因?然后如何研究该基因的基本功能?
(1)基因克隆：
1)选取感兴趣的基因高表达的组织或细胞，提取RNA，随机引物进行反转录得到cDNA，依据感兴趣基因两端的序列设计引物(两端有酶切位点)，用反转录所得cDNA作模板进行PCR，扩增感兴趣目的基因，对纯化的PCR产物及选好的合适克隆载体进行酶切，凝胶电泳回收，连接，转化入宿主细胞(一般为大肠杆菌)，在抗性平板上筛选，挑取克隆进行鉴定(提取质粒酶切验证或用针对cDNA设计的PCR引物进行菌落PCR筛选)。将正确的菌体克隆中的质粒提取纯化，记得到感兴趣基因的克隆。
2)用1)鉴定正确的质粒转化表达型宿主细胞，诱导表达大量目的基因产物(如多数质粒载体都可用IPTG诱导)，SDS-PAGE鉴定目的蛋白是否已表达且大小符合预期，大量表达，收集宿主菌体，超声破碎细胞，用层析等方法纯化蛋白，即得大量目的蛋白。
(2)功能研究：①体外，以所获目的蛋白为诱饵进行酵母双杂交，了解此蛋白质与已知功能的蛋白间的相互作用情况，初步预测了解其功能；②利用纯化的蛋白制备抗体，对不周组织活细胞进行Western Blot实验，观察其表达特异性；③可进行转基因实验进行过表达或RNAi，从上调和下调两个角度了解此蛋白在活体的功能。
2. 蛋白质可以有哪些修饰?其作用是什么?
新生肽链需经一系列后期加工才能形成有活性蛋白质，如N端起始氨基酸的切除和二硫键的形成。但蛋白质修饰更侧重于指代新生蛋白在氨基酸残基上形成的共价修饰。这一直是科学上的重要话题，至今文献报道已有超过200种修饰。新生蛋白的共价修饰不仅是蛋白质最终获得正确结构和功能的必备步骤，对蛋白质的共价修饰也是基因表达调控的重要过程。
(1)糖基化。包括N—糖基化和O—糖基化，影响肽链的折叠和蛋白质的分选定位。
(2)磷酸化。在多肽链丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羟基上，参与细胞信号转导和基因表达调控。
(3)甲基化。影响组蛋白与蛋白质和其他分子的相互作用。
(4)羟基化。胶原蛋白前α链上的脯氨酸和赖氨酸残基产生羟脯氨酸和羟赖氨酸，从而加强张力强度稳定蛋白质。
(5)乙酰化。防止肽链降解。
(6)羧基化。在谷氨酸位点上的羧基化可以引进钙离结合位点。
(7)碘化。酪氨酸位点上的碘化是甲状腺合成通路中的重要反应。
(8)泛素化。细胞内一些短周期蛋白被泛素化后以被降解。
(9)ADP—核糖化。调节某些酶的生物活性。
3. 试比较真核生物和原核生物的特点?
(1)细胞整体结构。真核生物细胞内存在多种膜包被细胞器，而原核生物细胞器较少。原核细胞无真核生物的典型核结构。
(2)染色体特点。
1)原核染色体结构特点：DNA裸露，无核小体结构；DNA为环状，分子较小，集中分布在拟核区域；DNA由环或结构域组成，并且这些结构的末端与细胞膜间存在联系蛋白从而被固定在膜上，单个结构是单独的负超螺旋，环形结构由于大量的DNA结合蛋白存在相互作用而被进一步束缚，这类蛋白被称为类组蛋白，具有压缩DNA作用；以操纵子模型为核心。
2)真核染色体结构特点：DNA与组蛋白结合，形成核小体结构；DNA为较大的线性分子，在核内组装；真核生物染色质结构主要包含200bp DNA与由4种组蛋白分子构成的八聚体核心，DNA与八聚体紧密结合形成核小体。核小体结构进一步压缩成直径30nm的纤丝，再进一步组装成高度有序的左手螺旋式螺线管结构。高级结构形成核基质；无操纵子结构。
(3)复制。真核原核生物DNA复制过程都是半保留、半不连续复制形式，都涉及到DNA聚合酶、连接酶等多种酶和蛋白因子的参与。但区别也有很多：①原核生物基因组有一个复制子，真核生物有多个；②原核的复制速度比真核的快；③原核生物的复制引物是由引物酶催化合成的，真核生物的引物由DNA聚合酶α催化合成；④真核生物端粒DNA合成由端粒酶催化完成，原核生物无此类结构。
(4)基因表达与调控：①原核生物在细胞结构、基因组和染色体结构上相比真核生物更为简单，原核生物细胞内基因的转录和翻译在同一时间空间内进行，基因的表达调控主要在转录水平进行，属于瞬时调控或可逆调控。原核生物通过由结构基因、调节基因及由调控基因产物所识别的控制序列(启动子、操纵基因)等所组成的操纵子对基因的表达进行调节。
(5)真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分割开，而且转录和翻译都有复杂的信息加工过程，其基因表达调控发生在各个阶段的不同水平上。
4. 请提出一套实验设计方案，研究癌症发生的分子机制?
(1)通过筛选找到一系列与癌症发生有关的基因，具体方法有基因表达谱分析、RT-PCR等。
(2)对候选基因逐个进行进一步研究，鉴定其属于原癌基因还是抑癌基因。
1)检测该基因所表达蛋白在肿瘤组织中和正常细胞中的表达量。如果和正常组织相比，在癌细胞中该蛋白表达量很低甚至没有，该基因很可能是肿瘤抑制基因(tumor uppressor gene)。如果相比之下癌组织中该蛋白高表达，则该基因是癌基因(oncogence)。
2)进一步实验：敲除该基因在正常细胞系中的表达或抑制该基因表达，观察细胞转化的效果，与肿瘤组织进行比较分析。如果该基因被抑制后，细胞分裂性增强，可初步确定该基因为肿瘤抑制基因。若减弱分裂则确定是癌基因。
(3)对已分析的各个基因上下游通路的关系通过遗传学手段予以研究。
综合以上手段，可得出关于癌症发生的初步分子机制。
深色：已答题 浅色：未答题