(1)Ti质粒介导的基因转移：农杆菌都携带有一种称为Ti的质粒(tumol-inducing plasmid)，该质粒上有一段DNA，称为T-DNA(transfer-DNA)，它能转移并整合进植物基因组中。将目的DNA片段插入T-DNA区，然后通过土壤农杆菌和Ti质粒将它送入受体植物，插入植物细胞基因组内。
   (2)基因枪技术：借助于高速运动的金属微粒将附着于其表面的DNA导入受体细胞中的技术。

两种质粒不能稳定共存于同一个细胞中的现象。同一不亲和群中的质粒具有相同的复制机制，相互间产生干扰。同时，细胞分裂时细胞质的不均等分配也是其原因之一。

人工合成的一段含有限制性内切核酸酶识别位点的一小段DNA。连接到载体或外源DNA片段上，从而方便地制造出新的酶切位点，便于二者的连接。主要用途是介导载体和插入片段的高效结合。

简并引物PCR、合成寡核苷酸探针筛选基因组文库或cDNA文库、构建cDNA表达文库利用相应的抗体筛选。

具有cos位点的质粒载体就是黏粒。由于它具有该位点可以被λ噬菌体的包装蛋白包装，从而具有克隆大片段外源DNA的能力。

改造质粒的复制特性和可选择性，把选择性标记引入到松弛型质粒中；调整质粒的结构，提高载体的效率，把载体的长度降低到最小，添加多克隆位点；在质粒中引入多种用途的辅助序列。

(1)技术上的三大突破：1970年Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌(hatmonphilus influenzae)中分离和纯化限制性内切核酸酶HindⅡ；基因工程载体的构建——质粒和噬菌体的有关研究；Mendel M.和HigaA．确立的基因转化技术。此外，在20世纪60至70年代确立了多种基本研究技术如琼脂糖电泳、核酸杂交等。
   (2)理论上的三大发现：1944年，Avery发现DNA是遗传物质；1953年Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型；60年代众多学者共同阐明中心法则。

GTTAAC的出现频率是4⁶，即4.096kb；GGCC的出现频率是4⁴即0.256kb。

不同物种中对64种密码子的使用频率有较大的差异称为遗传密码子偏好；很少使用的密码子，在细胞中其相应的tRNA就很少；如果基因的编码序列中存在这些密码子，在翻译时就需要较长的时间等待相应tRNA的到来，使得翻译效率降低。

获得目的基因——抗虫基因；把抗虫基因与一定的载体(如Ti质粒)连接形成重组体DNA；转化棉花的细胞；培养出愈伤组织和试管苗；筛选出具有抗性的试管苗；把试管苗种植并与普通棉花杂交筛选并培育为品系。

品系A整合了—个拷贝的卡那霉素抗性基因；品系B整合了两个拷贝的卡那霉素抗性基因，且位于不同的染色体上。

提取正常组织和A基因过度表达的组织的mRNA进行差减杂交。

原因是多方面的：①目前尚难于对多个基因同时进行转移；②目前尚难于对基因在转基因植株中的位置进行控制；③与高产、抗逆及其他优良品质相关的基因还没有克隆；④基因组是经过漫长的进化形成的相互协调的整体．过多外源基因的插入无疑会干扰其协调性，从而影响其生存和品质。

质粒上含有lacZ'基因，此基因为lacZ的5'端，编码氨基端；宿主菌中含有lacZ基因的3'端，编码羧基端；二者同时存在时发生分子内互补，成为具有活性的LacZ蛋白；当培养基中含有IPTG和X-gal时可以形成蓝色化合物。

构建大麦的基因组DNA文库；把水稻的矮秆基因标记后作为探针筛选该文库。

①基因的整合位点位于异染色质中，不能转录；可以用Northern杂交证明；②基因的表达有时间和空间的特异性，检测时发育时期和组织器官选择不当，改变检测的时间和选择更多的组织器官；③由于稀有密码子等的存在使得mRNA不能有效翻译，可以通过Northern杂交证明；④基因转录了，但mRNA被降解，可以通过Northem杂交证明

用通用缓冲液；先用低盐酶，后用高盐；先低温后高温。

把Neurospora的β-tubulin基因标记作为探针。选者在质粒pBR中具有唯一切点的HaeⅡ消化该质粒，制备Podospora的基因组或cDNA文库。筛选tet^rkan^s克隆找出含有该基因的克隆。

用枯草杆菌蛋白水解酶处理DNA聚合酶Ⅰ，得到一个大的片段，具有3'→5'外切酶活性和5'→3'聚合酶活性，失去了5'→3'外切酶活性的酶。主要用途包括：补平DNA的突出单链末端；标记3'突出端；随机引物法标记DNA探针等。

①收集不同的患者家系(人类中)或进行一定的杂交(测交或自交，动植物中)；②分析多个形态标记或分子标记与目的基因的遗传规律；③根据连锁情况，进行基因定位。

用HindⅢ和EcoRⅠ或KpnⅠ切割A质粒和B质粒，把切割片段重组连接后转化大肠杆菌，筛选出具有氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性的克隆。

电泳后，利用放射性同位素或地高辛或生物素标记已克隆的基因作为探针进行Southern印迹。

前者不含内含子，后者有。前者仅是部分结构基因的克隆，后者包含了基因组的全部信息。

在主要基因间隔区含有突变，使得自身DNA复制效率低下的一类噬菌体突变体。但它们可以为寄主中噬菌粒的复制与包装提供蛋白酶与外壳蛋白，同时噬菌粒中所具有的复制子完全正常，可以利用这些蛋白质迅速复制自身。

①所用启动子为组成型强启动子，使得目的基因在所有组织和器官中表达，影响转基因植株的代谢和生长，从而影响该聚合物的合成。②乙酰辅酶A为生命活动中的重要物质，目的基因的表达产物与植株内的基因竞争该底物．影响转基因植株的代谢和生长，从而影响该聚合物的合成。③遗传密码子的偏爱。

不同物种中对64种密码子的使用频率有较大的差异称为遗传密码子偏好；很少使用的密码子，在细胞中其相应的tRNA就很少；如果基因的编码序列中存在这些密码子，在翻译时就需要较长的时间等待相应tRNA的到来，使得翻译效率降低。

正常的体外合成体系中，DNA聚合酶在引物的引导下，沿模板链的3'→5'方向移动，利用体系中的4种2'-脱氧核糖核苷酸(dNTP)聚合成一条与模板互补(沿5'→3'方向)的DNA新生链。如果在体系中加入2'，3'-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，当它们掺入正在合成的新链DNA后，由于其在脱氧核糖3'位置上没有羟基，因而不能与后续dNTP的5'磷酸基团之间形成磷酸二酯键，合成中的新DNA链在这个位置上终止延伸。这样如果在DNA合成体系中，既有正常反应所需的4种dNTP，同时又加入了一定比例的ddNTP，那么新合成的DNA链在掺入这种dNTP的位置，即可能掺入同种ddNTP，导致新合成链在凡是应该掺入这种核苷酸的位置就有可能随机终止。由于存在这样一种ddNTP与同种dNrrP的竞争，合成产物即为一系列长度不同的多核苷酸片段。这些片段的5'端是固定的，而终止点随模板链碱基序列而改变。5'GCGAAGAGT 3'

加抗生素Tet；抗Tet，对Kan敏感；把涂皿形成的菌落影印到新的含Kan的平皿中，凡是不能生长的克隆就是阳性克隆。

①把已经克隆的基因经标记作为探针使用。从根或其他非光合组织中提取RNA进行Northem印迹。②设计特异引物，从根或其他非光合组织中提取RNA进行RT-PCR，或荧光定量PCR。

①引物不同。普通PCR为双引物，且较长20bp左右；RAPD用单引物且较短，10bp左右；②复性温度不同。普通PCR较高，45℃以上；RAPD较低，40℃以下；③扩增产物不同。普通PCR产物序列已知，且单一；RAPD产物未知且多样。

(1)基本原理：在高温下使DNA变性成为单链；在较低的温度下引物与单链DNA在互补位置结合，形成复合物。把温度调节到DNA聚合酶的最适温度，以dNTP为原料，以单链DNA为模板从引物的3'端开始合成一条新的DNA双链。重复这一过程就可以使靶DNA特异扩增。
   (2)应用：用于制备目的PCR、用于检测目的PCR、用于引入突变的PCR、用于扩增未知区域的PCR等。

把正常植株的基因组DNA与隐性矮秆植株的基因组DNA进行差减杂交。

复制起点、着丝粒和端粒。具有克隆数百kb碱基对DNA的能力。因此，利用它作载体构建基因文库可以显著减少克隆的数目，降低在因文库筛选的难度，同时也加快了染色体步移的速度。

酶切条件的改变会对限制性内切核酸酶的专一性造成影响，识别序列和切割都有一些变化，改变后的活性就是星号活力。诱发因素包括：甘油浓度大于5%；限制酶过量；低离子强度；高pH；有机溶剂的存在；非Mg²⁺的二价阳离子存在等。

采用缺失的方法，使野生型的酶失去3'→5'外切酶活性，保留聚合酶活性，聚合能力提高了数倍。属于序列测定专用酶。

Southern杂交用于检测待测DNA样品中是否含有与探针同源的DNA片段和大小。
   Northern杂交用于检测待测RNA样品中是否含有与探针同源的RNA片段和大小。
   点印迹只能检测DNA和RNA样品中是否含有与探针同源的片段而不能得知其大小；但操作简便。
   Western杂交利用抗体抗原反应检测某一蛋白质的存在与否。

对氨苄青霉素有抗性的细菌；对氨苄青霉素有抗性、对卡那霉素无抗性的细菌。